Inlog menu bovenin

Microbiologische methoden: snel en gestandaardiseerd graag

FiMM organiseerde op donderdag 13 oktober het symposium ‘Methoden in de levensmiddelenmicrobiologie’. Een drukke dag waarbij lezingen werden afgewisseld met bezoeken aan fabrikanten van laboratoriumbenodigdheden. Ruim twintig bedrijven stonden er met hun stands.

De eerste lezing kwam voor rekening van een duo: Aurel Ymeti van Ostendum en Jos Böhmer van Zwanenberg Food Group. ‘Lab-on-a-chip: virussen, bacteriën, DNA en eiwitten meten in minuten. Een stille wens of realiteit?’, was de titel. Ymeti vertelde over het principe van de methode: meerdere specifieke antilichamen, bijvoorbeeld tegen bacteriën en/of virussen, gecoat op een kleine chip (zie figuur 1). De te testen vloeistof (water, bloed, melk, een verdunning van een levensmiddel) wordt over de chip en langs de antilichamen geleid. Bacteriën of virussen aanwezig in de vloeistof binden zich aan de antilichamen op de chip. Na de binding volgt belichting met laserlicht. Een speciale camera registreert de bindingsplaatsen, en het resultaat is beschikbaar. Real time, en zo te horen geen enkel probleem.

Dat geldt zeker voor het aantonen van specifieke stoffen in een relatief schone matrix zoals melk. Voor het aantonen van pathogene micro-organismen in levensmiddelen, waarbij vaak een afwezigheid in 25 gram product wordt geëist, ligt het minder makkelijk. Real time meten kan dan pas na een ophopingsstap.

Böhmer vertelde over de problemen waar ze nu nog tegenaan lopen met het aantonen van Listeria monocytogenes in leverworst. De problemen zijn ondermeer vervuiling van het systeem en de chips door productresten, de grootte van de matrixdeeltjes en het geen onderscheid kunnen maken tussen dode en levende micro-organismen. Het apparaat kan in melk, een minder moeilijke matrix dan leverworst, 10 kolonievormende eenheden (kve) Listeria monocytogenes per ml aantonen.

Beide sprekers zien, na het oplossen van de problemen, een grote toekomst voor dit apparaat.


Figuur 1. Het principe van ‘Lab-on-a-chip’.

Daarna besprak Arnold Dijkstra, van CSK Food Enrichment, de voor- en nadelen van semi snelle methoden als Petrifilm, CompactDry en SimPlate (zie ook figuur 2). Averechtse methoden noemde hij ze. Ze zijn al tussen de 10 en 25 jaar op de markt met vaak goede ervaringen van gebruikers. Kleinere laboratoria maken vaak gebruik van deze semi snelle analyses. Bijvoorbeeld omdat er steeds minder analisten zijn in het laboratorium of omdat de onderzoeken weinig worden uitgevoerd. De bedrijven maken dan een afweging tussen gemak, efficiency en kosten.

Volgens Dijkstra bieden de methoden zeker een meerwaarde ten opzichte van de traditionele microbiologische onderzoeken, maar plaatste hij de volgende twee kanttekeningen:

  1. Valideer en verifieer de methoden in de eigen praktijk met eigen matrices.
  2. Zorg voor een goede opleiding van de mensen die ermee werken. Hoewel de systemen simpel zijn in het gebruik, is het belangrijk dat iemand met verstand van zaken de resultaten bekijkt. Onoordeelkundig gebruik leidt tot afwijkende resultaten.

 

Figuur 2. Voorbeelden van SimPlate (links), Petrifilm (rechts) en CompactDry (rechts).

Wim Reybroeck, onderzoeker van het Belgische Instituut voor Landbouw- en Visserijonderzoek (ILVO) maakt geen gebruik van de semi snelle methoden van Dijkstra. Hij pleit juist voor het gebruik van de ATP-bepaling als een snelle, breed inzetbare microbiologische methode.

Reybroeck lichtte toe dat alle levende cellen ATP (adenosinetrifosfaat) bevatten. Dat voorziet de cel van energie. Dode cellen verliezen hun ATP-gehalte snel. Veel ATP betekent daarom dat er veel levende cellen zijn.

De hoeveelheid ATP is te meten dankzij bioluminescentie. Dat is een enzymatische reactie waarbij ATP reageert met luciferine en het enzym luciferase. Beide stofjes komen uit vuurvliegjes. Bij de reactie komt licht vrij. Een luminometer meet de lichtintensiteit uitgedrukt in Relative Light Units (RLU).

Reybroeck onderscheidt microbieel ATP, niet-microbieel ATP (voedingscellen en somatische cellen) en vrij ATP (van beschadigde cellen). Alleen microbieel ATP is geschikt als maat voor het aantal micro-organismen in een voedingsmiddel. En daar zit het probleem van de bepaling. De andere twee vormen van ATP mogen niet in het monster voorkomen anders is er geen link meer met het aantal micro-organismen. Zuivering van het monster is daarom noodzakelijk. En volgens Reybroeck kan dat. Zijn onderzoekers ontwikkelden drie verschillende soorten reagentia. Na behandeling van monsters met de reagentia blijft alleen microbieel ATP over. Zie ook figuur 3.

 

Figuur 3. Het principe van de ATP-bepaling.

Hij benadrukt de snelheid van de bepaling. Zo duurt de kiemgetalbepaling van rauwe melk nog geen 6 minuten met een detectielimiet van 10.000 kolonievormende eenheden (kve) per ml en duurt de kiemgetalbepaling van gemalen vlees 2 uur. Volgens Reybroeck is de ATP-techniek goed bruikbaar voor snel microbiologisch onderzoek van ondermeer vleeskarkassen, frisdranken, bier, water en melk. Het is voor hem een raadsel waarom microbiologen de ATP-bepaling niet accepteren als methode voor het bepalen van het kiemgetal.

De ATP-bepaling is wel geaccepteerd als controlemethode na reiniging in levensmiddelenbedrijven. Ruurd Schat, sector specialist van Diversey BV benadrukte het belang van de bepaling. De methode is snel, eenvoudig uitvoerbaar en objectief. Het aantal RLU’s geeft aan of er goed of slecht is schoongemaakt. En alleen de totale hoeveelheid ATP telt, niet alleen het microbiële ATP.

“Als het gehalte te hoog is, is er niet goed schoongemaakt”, zegt Schat. “Het maakt niet uit of het komt van micro-organismen of van andere cellen”.

Bij de ATP-meting is validatie en het vaststellen van grenswaarden essentieel. Schat zegt daarover: “Gissen is missen, meten is weten”. Hij noemt de volgende twee manieren:

*       Officiële methode:

Voer de ATP-meting van Critical Control Points (CCP’s) enige tijd uit in combinatie met de controle op het algemeen kiemgetal van dezelfde CCP’s.

*       Afgeleide methode:

Maak gebruik van reeds bestaande grenswaarden in een bepaalde productieomgeving. Leveranciers van ATP-systemen hebben deze waarden.

Niet alleen de snelheid van een bepaling is belangrijk voor de doeltreffendheid van het onderzoek. Paul in ’t Veld van de nieuwe Voedsel en Waren Autoriteit (nVWA) onderstreept het belang van goede monstername. “Het monster moet representatief zijn voor de gehele partij. Dit schrijft de norm ISO 7218 voor”, zegt In ’t Veld. Hij denkt dat monsters vaak lukraak genomen worden. Terwijl dat eigenlijk niet moet. Het is juist een belangrijk onderdeel van het onderzoek.

Een ander belangrijk punt is de grootte van de testportie: de hoeveelheid monster dat nodig is voor het maken van de primaire verdunning. De ISO 6887-serie schrijft minimaal 10 gram voor als testportie. Uit een in 2008 uitgevoerd Frans onderzoek bleek dat de grootte van de testportie een groot effect heeft op de meetonzekerheid van de analyses. De nVWA herhaalde dit onderzoek in grote lijnen. Onderzoekers van nVWA onderzochten het effect van de grootte van de testportie op de spreiding van de resultaten.

Ze onderzochten de matrices ijs/milkshake (homogeen monster), nasi (heterogeen), voorverpakte gesneden (gemengde) groenten (erg heterogeen) op totaal kiemgetal. Van alleen de groenten bepaalden ze daarnaast het aantal Enterobacteriaceae. Zie figuur 4 voor de opzet van het onderzoek.

De spreiding tussen de kiemgetallen was het kleinst als de primaire verdunning in twee stappen werd gemaakt. Eerst 100 gram testportie één op één verdunnen en daarna 10-15 gram 1:4 verdunnen. Een grotere testportie (30 gram of 100 gram) leidde niet tot een kleinere spreiding in de resultaten.

Figuur 4. Schematische weergave van de proefopzet.

Enne de Boer, eveneens van de nVWA, besprak de huidige stand van zaken op het gebied van de internationale normalisatie van microbiologie. Op Internationaal niveau is er de International Organization for Standardization (ISO) en op Europees niveau de CEN: Comité Européen de Normalisation. Op microbiologisch gebied is er nauwe samenwerking tussen beide organisaties. De Boer legde eerst de organisatie rondom de normontwikkeling uit. Daarna het proces van normontwikkeling en welke nieuwe normen eraan komen of die binnenkort wijzigen.

Enkele ontwikkelingen zijn:

*       Er komt een conceptnorm uit voor het aantonen van shigatoxine producerende Escherichia coli (STEC) met een PCR-methode.

*       Een ontwerpnorm voor de bepaling van staphylococcen-enterotoxinen is al gepubliceerd.

*       En er zijn conceptnormen voor de kwalitatieve en kwantitatieve bepaling van hepatitis A-virus en norovirus met PCR.

In de toekomst komen er normen voor het aantonen van de parasieten Cryptosporidium, Giardia en Trichinella en tellingen van het aantal psychrotrofe clostridia in vlees en Alicyclobacillus acidoterrestris. De ISO/CEN reviseert de normen voor Salmonella, Campylobacter, Listeria (zie figuur 5), Enterobacteriaceae, gisten en schimmels, Pseudomonas en totaal kiemgetal.

Figuur 5. Revisie van Listeria onderzoek (CAMP-test).

Rijkelt Beumer van Wageningen Universiteit sloot de lezingenreeks af. Hij stelt dat standaardisatie in de levensmiddelenmicrobiologie belangrijk is. En dat microbiologen koppig zijn. “ Microbiologen zullen eerder elkaars tandenborstel gebruiken dan elkaars methoden”, citeert Beumer de markante professor Mossel.

Toch is werken met de beste kwaliteit media belangrijk. Daarvoor is de norm CEN/ISO 11133 ontwikkeld. De norm bestaat uit twee delen: deel 1 beschrijft de algemene richtlijnen voor ‘quality assurance’ bij het bereiden van media in het laboratorium, deel 2 de praktische richtlijnen voor ‘performance testing’ van voedingsmedia.

Beumer legt uit welke manieren er zijn om zowel vaste als vloeibare media te toetsen en hoe je dat moet doen. En hij besprak enkele resultaten. Wat hem opviel was dat bacteriën op dezelfde media maar afkomstig van verschillende fabrikanten, er heel anders uitzien na bebroeden. Terwijl je dat eigenlijk niet verwacht. Zo zien Escherichia coli-kolonies op VRBL van Oxoid er veel groter uit dan op VRBL van Merck. En zijn er grote verschillen te zien tussen Listeria monocytogenes-kolonies op ALOA van AES, Oxoid en Biomerieux. De kwaliteit van de alle media was overigens goed voor alle merken.

Figuur 6. Invloed van ouderdom voedingsmedium (TSC voor onderzoek Clostridium perfringens) op de productiviteit.